亚美体育脂肪酸去饱和酶代表一类氧依赖性酶，正在脂肪酸分别处所引入双键，将饱和脂肪酸降饱和为不饱和脂肪酸，催化脱饱和响应，从而发作单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。动作脂肪酸合成途径中的环节酶参加脂肪酸的合成，对微生物脂肪酸双键处所、组织、数目发作特异性影响，不光能够补充脂肪酸的不饱和度，又有利于鞭策脂质积聚，对维护生物膜平常组织和效用拥有要紧事理。咨询剖明，不管是单表达仍是共表达去饱和酶基因，都可正在肯定水平上提升微生物的油脂含量、刷新其饱和、不饱和脂肪酸的构成比例。

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HB1310是1 株已报道的高产油核桃内生菌，饱和酶是该菌株脂肪酸合成途径中的环节酶之一，安徽工程大学的叶景、徐思远、张琴*等人将克隆其去饱和酶基因de1、de2，杀青这两种基因正在i BL21（DE3）中的单表达与共表达，探究去饱和酶基因过表达对E.coli油脂产量及其脂肪酸组分的影响，得回高效的产油工程菌，以期为高产油工程菌的斥地和行使供应技巧维持。

　　采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对 de1、 de2、 de基因的PCR扩增产品实行检测，结果如图1所示。从电泳图可看出，3 个基因的PCR扩增产品碱基长度约1 036、822、1 856 bp，与预期目的条带巨细相符，剖明这些基因片断扩增得胜。

　　重组表达质粒pET-28a-de1、pET-28a-de2、pET-28a-de抽提纯化，诀别采用束缚性内切酶EcoR I/Xho I、BamH I/Xho I、BamH I/Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，各重组表达质粒酶切后均发作两条带（图2），个中大片断均与质粒pET-28a单酶切片断长度相同，幼片断诀别与de1、de2、de基因的宗旨片断长度相同，进一步测序结果表明3 个基因的重组表达质粒均构修得胜。

　　将重组质粒转化至BL21（DE3）获得工程菌株BL21（DE3）/pET-de1（DE1），BL21（DE3）/pET-de2（DE2）及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de（DE），对工程菌株实行PCR检测、质粒及酶切验证，序列比对结果显示工程菌构修得胜。

　　3 工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达产品的SDS-PAGE阐述

　　对工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达的酶卵白实行SDS-PAGE检测，结果见图3。与 E. coli BL21（DE3）的卵白SDS-PAGE结果实行对照阐述，发觉工程菌株DE1、DE2的重组酶正在分子质地约40、32 kDa操纵的条带诀别较 E.coli BL21（DE3）昭彰加深，与表面分子质地较挨近（DE1的为39.8 kDa，DE2的为31.8 kDa）。结果剖明，去饱和酶基因 de1 、 de2 正在 E.coli BL21（DE3）中杀青了高效单表达和共表达。

　　对工程菌株DE1、DE2、DE提拔6 0 h内的OD 600nm 实行监测，其发展弧线 h操纵达发展峰值，其后发展趋于平静。从提拔进程的发展弧线 株菌株发现与野生菌株好像的发展弧线，阐发表源的去饱和酶基因 de1 、 de2 单表达和共表达进程中，工程菌株仍能维护有用的发展。然而，24～60 h，工程菌株的发展均略低于野生菌株，恐怕因为表源基因表达进程中，插入新的酶会形成合成代谢扰乱内源性代谢，合成代谢和内源性代谢之间的角逐导致代谢责任，从而导致宿主的应激响应和心理蜕变，惹起工程菌株发展量的下降。

　　红四氮唑动作一种氧化剂，能够从去饱和酶领受电子，后自己从无色被还原为赤色的甲攒，从而能够表征细胞内去饱和酶活性。工程菌株和野生菌株60 h内的酶活性蜕变弧线、DE的去饱和酶活性正在60 h诱导进程中均高于野生菌株，尤以24 h的酶活性最高，诀别为同时辰野生菌株的1.38、1.48 倍和1.75 倍，剖明去饱和酶基因 de1 、 de2 正在24 h内即杀青了高秤谌的表达；24 h后工程菌株酶活性呈低重趋向，恐怕是因为表源基因的过表达导致 E.co li 中造成豪爽的饶恕体。而发酵后期跟着养分物质损耗以及细菌发展进入阑珊期 ，去饱和酶活性趋于稳定，但仍略高于或与野生菌株的酶活性挨近。

　　6 去饱和酶基因de1、de2单表达和共表达对油脂产量及脂肪酸组分的影响

　　为最大水平清除恐怕因为饶恕体的造成导致个人菌株去饱和酶活性低重，而形成后续实行对细菌脂肪酸产量及脂肪酸构成因素的实行谬误，本咨询仅汇集了工程菌株和野生菌株发酵24 h的菌体样品实行细菌油脂的提取及其脂肪酸组分阐述。

　　如图6所示，去饱和酶基因的表达有用巩固了细菌脂质的积聚，与野生菌株比拟，工程菌株的油脂产量和质地分数均明显提升。DE1、DE2、DE的油脂产量诀别可达0.57、0.58、0.72 g/L，均较野生菌株提升83%以上，而油脂质地分数从野生菌的9.45%提升至18.44%以上，诀别较野生菌株提升97.78%、95.17%、135.09%。总的来看，去饱和酶基因 de1 与 de 2 共表达对油脂产量和含量提升的鞭策效力明显优于这两个基因单表达的食品，这与Yan Fengxin等正在解脂耶氏酵母表达Δ12和Δ15去饱和酶基因鞭策脂质积聚成效更明显的结论相同。

　　将提取的细菌油脂实行甲酯化后，操纵气相色谱对脂肪酸组分实行定性和定量阐述。基于37 种脂肪酸甲酯混标对油脂样品实行阔别定性，对比轨范品参考图谱得出各组分的出峰时候，采用十五烷酸甲酯动作内标对脂肪酸甲酯实行定量阐述。菌株脂肪酸组分及其质地分数见表3。

　　表3显示，E.coli BL21（DE3）的油脂脂肪酸组分以棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）为主，其次为豆蔻酸（C14:0）、亚油酸（C18:2）。3 株工程菌中油脂脂肪酸仍以上述4 个组分为主，但各组分的质地分数却产生了昭彰的蜕变。个中，C8:0、C15:1、C18:0脂肪酸质地分数均高于野生菌株，越发是工程菌株DE1、DE中的不饱和脂肪酸组分C15:1、C18:2、C22:2质地分数均明显高于野生菌株。为揭示去饱和酶基因de1、de2单表达及共表达对油脂脂肪酸组分的影响，统计了工程菌株DE1、DE2、DE有关于野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸的提升量。如图7所示，工程菌株中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量均提升，饱和脂肪酸含量诀别提升72.26%、66.93%、123.21%，不饱和脂肪酸含量诀别提升112.18%、44.18%、134.30%，剖明去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的刷新。

　　表面上，去饱和酶特异性地鞭策成熟脂肪酸中顺式双键的造成，将饱和状况下的脂肪酸去饱和，环节组织域和环节位点组成去饱和酶的活性中央并影响其活性，且分另表催化底物对催化速度也发作肯定的影响。有咨询剖明，脂肪酸去饱和酶的类型、表达秤谌和活性决议了不饱和脂肪酸的定性和定量构成，额表去饱和酶的过表达能够鞭策细胞内单不饱和脂肪酸的富集和脂质积聚，从而到达刷新脂肪酸组分的成效。本咨询通过对工程菌株有关于野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸含量的提升量实行统计阐述，证据了去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的刷新，越发是不饱和脂肪酸含量的提升。表4总结了近年来酵母菌和E.coli中过表达去饱和酶基因惹起菌株不饱和脂肪酸组分和含量蜕变的咨询结果，可见去饱和酶关于脂肪酸组分的刷新至合要紧，过表达分别泉源的去饱和酶基因关于高产油工程菌或额表组分工程菌的构修拥有要紧行使代价和表面事理。

　　正在E.coli BL21（DE3）中表达了来自产油核桃内生菌B.subtilis HB1310的去饱和酶基因，构修了单基因表达菌株BL21（DE3）/pET-de1、BL21（DE3）/pET-de2及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de，杀青了去饱和酶基因的高表达，有用鞭策了E.coli去饱和酶活性的提升，使脂肪酸积聚量得以补充，提升了菌株油脂产量和含量，刷新了脂肪酸组分，越发使不饱和脂肪酸含量明显提升。本咨询可为产油脂工程菌的斥地和行使供应有代价的菌种泉源，对高效产油工程菌的构修拥有肯定的行使代价。

　　本文《过表达去饱和酶基因对大肠杆菌脂肪酸合成的影响》泉源于《食物科学》2023年45卷第2期72-78页，作家：叶 景食品，许思远，张 琴，钱 程食品，曹娟娟食品，赵 沛。DOI:10.7506/spkx0509-076。点击下方 阅读原文即可查看作品干系讯息。

　　练习编纂：天津贸易大学生物技巧与食物科学学院 梁雯菁；职守编纂：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片泉源于作品原文及摄图网。

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